Žygimanto Augusto nurodymu ji 1551 m. nugriauta, toje vietoje pastatyta Šv. Onos ir Barboros vienanavė bažnyčia. Manoma, kad jos architektas Džiovanis Činis. Bažnyčia buvo renesansinė. Po Žygimanto Augusto mirties neužbaigta, 1655 m. apgriauta, 1666 m. visai nugriauta. Dabartinė Šv. Onos bažnyčia prie Bernardinų vienuolyno pastatyta 1495–1500 m. Jai 1501 m. popiežius Aleksandras VI paskelbė atlaidus. Dailės istoriko D. Kačmažiko teigimu, bažnyčią projektavo ir statė Mykolas Enkingeris.
Pastatyta bažnyčia naudojosi vokiečių ir kitų svetimtaučių katalikų Šv. Martyno brolija. Kilus reformacijai, 1557 m. vyskupas uždraudė jai naudotis bažnyčia. Netrukus brolija iširo, o apie XVII a. pradžią vėl susibūrė. Ji Šv. Onos bažnyčia naudojosi 1607–1613 m., 1795–1812 m. ir 1824–1940 m. Be to, bažnyčia 1501–1864 m. naudojosi Šv. Onos brolija.
1560 ir 1564 m. bažnyčia degė. Iki 1582 m. rekonstruota dvaro arkivyskupo Dimitrijaus Solikovskio, Vilniaus vaivados Mikalojaus Radvilos ir kardinolo Jurgio Radvilos lėšomis, 1610 m. nukentėjo nuo gaisro. 1613 m. prie presbiterijos šiaurinės pusės pastatyta zakristija. Per karą 1655 m. nuniokota. Po jo nutinkuotas ir išbaltintas bažnyčios vidus, pastatyti barokiniai altoriai.
Šv.Onos bažnyčios varpinė
1747 m. bažnyčia remontuota (vadovavo architektas Jonas Kristupas Glaubicas). 1762 m. nugriautas pietinio fasado prieangis, užmūrytos pagrindinio portalo šoninės arkos. 1794 m., per Vilniaus apšaudymą, bažnyčia apdegė, sienose atsirado plyšių. Apie 1800 m. architektas Mykolas Angelas Šulcas ją restauravo, nutinkavo, o 1802 m. prieš bažnyčią pastatė 3 tarpsnių varpinę.
1812 m. bažnyčia paversta karo sandėliu, medinis inventorius sudegintas, altoriai sudaužyti. Ji suremontuota tik 1824 m. Tiesiant 1870 m. naują gatvę, nugriauta varpinė. Naujos varpinės statybai ir bažnyčios remontui valdžia skyrė 24 406 rb. Pagal Nikolajaus Čiagino projektą 1872 m. pastatyta nesiderinanti su bažnyčios gotika mūrinė varpinė. XIX a. pabaigoje nusėdo bažnyčios pamatai, sutrūkinėjo ir pasviro sienos.
Kanauninko Jono Laboko rūpesčiu pagal architekto Juzefo Pijušo Dziekonskio ir inžinieriaus Aleksandro Antonovičiaus projektą 1902–1909 m. bažnyčia restauruota. 1925 m. įkurta parapija. 1960–1970 m. pagal inžinierės Janinos Bartkienės projektą sutvirtinti yrantys bokštai.